技術(shù)交流

狂犬病是危害人類健康的最古老疾病之一，由狂犬病病毒引起，人類患者一旦發(fā)病，病死率幾乎為100%，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，也是人類尚未能有效控制的疫病之一?？袢∫呙缡穷A(yù)防狂犬病唯一有效的方法。歐洲和北美的許多國(guó)家已持續(xù)多年無(wú)狂犬病發(fā)生，得益于采用狂犬病口服疫苗對(duì)野生動(dòng)物進(jìn)行誘餌口服免疫。在愛沙尼亞、法國(guó)、意大利、瑞士、芬蘭等國(guó)家大規(guī)模應(yīng)用狂犬病口服疫苗后僅幾年就使這些國(guó)家消除了狂犬病。對(duì)我國(guó)2004年至2018年國(guó)內(nèi)動(dòng)物狂犬病病例進(jìn)行回顧性調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.33%(33/10118)的犬被確診為狂犬病陽(yáng)性，陽(yáng)性犬中29只屬于流浪犬，因此在我國(guó)對(duì)流浪犬進(jìn)行狂犬病免疫可有效減少人狂犬病的發(fā)生。由于狂犬病毒的流行面積和宿主范圍非常廣泛，單靠注射免疫很難消滅狂犬病毒，特別是對(duì)于城市的流浪動(dòng)物，用口服疫苗大面積免疫是消滅犬狂犬病的最有效方法。

歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家從1978年就開始大規(guī)模應(yīng)用減毒活疫苗預(yù)防動(dòng)物狂犬病，并明顯降低了野生動(dòng)物狂犬病的發(fā)病率，同時(shí)也極大減少了被動(dòng)物致傷發(fā)生的家畜狂犬病和暴露后免疫人數(shù)，最終消除了這些國(guó)家的人間狂犬病。早期應(yīng)用于疫苗的減毒株主要有重組痘病毒V－RG株，和一些不同減毒水平的減毒株，如ERA株、SADBern株、SADB19株和SAD5/88株，雖然這些毒株毒力顯著減弱，但仍然對(duì)小鼠和其他野生動(dòng)物保留殘余毒力，存在傳播感染的危害性。相比之下重組疫苗存在較多的優(yōu)勢(shì)，不僅安全可靠，而且可通過口腔、胃腸黏膜進(jìn)行抗原遞呈，較傳統(tǒng)注射途徑免疫效果好且簡(jiǎn)易便捷。表達(dá)狂犬病毒糖蛋白重組復(fù)制缺陷型人5型腺病毒活載體疫苗rAd5－ΔE1/E3－CGS已被證實(shí)能夠產(chǎn)生抗狂犬病毒的保護(hù)性抗體，是一種安全、可靠、高效的動(dòng)物狂犬病候選疫苗，但其穩(wěn)定性受到餌料制備、儲(chǔ)運(yùn)條件、儲(chǔ)存時(shí)間及投放環(huán)境等因素的影響。為探索rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗消減規(guī)律，本研究依據(jù)餌料制備、儲(chǔ)存運(yùn)輸、環(huán)境投放等情況設(shè)計(jì)方案，選取不同劑型疫苗，經(jīng)儲(chǔ)存運(yùn)輸、反復(fù)凍融、環(huán)境投放不同階段考察疫苗的效價(jià)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，為rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗的劑型研制、儲(chǔ)備運(yùn)輸、免疫程序提供技術(shù)參考。

1.1疫苗、犬天然誘食劑、口服疫苗佐劑和細(xì)胞

rAd5－ΔE1/E3－CGS(農(nóng)基安證字(2020)第202號(hào))由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所提供；犬天然誘食劑由上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供；口服疫苗佐劑由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供；293A細(xì)胞購(gòu)自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(批號(hào)：2126865)、0.25%濃度胰酶消化液(批號(hào)：2142303)均購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清(批號(hào)：2418)購(gòu)自SIGMA公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(批號(hào)：25200601)購(gòu)自美國(guó)Costar公司。

1.3 口服疫苗制備(見表1)

1.3.1 rAd5－ΔE1/E3－CGSTCID₅₀測(cè)定

rAd5－ΔE1/E3－CGS同步接種293A細(xì)胞，置37℃含5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)48~72h，待80%細(xì)胞出現(xiàn)聚集、圓縮、脫落等細(xì)胞病變，將培養(yǎng)液凍融三次，2000r/min離心5min，取上清備用，同時(shí)按照Reed－Muench法測(cè)定TCID₅₀。

1.3.2 口服疫苗凍干劑制備

將疫苗稀釋至1.0×10⁸TCID₅₀/mL，加入等體積的脫脂奶溶液(0.1g/mL)，按照2mL/頭份進(jìn)行分裝，真空、凍干，－20℃保存?zhèn)溆?，一周以后測(cè)定其TCID50。

1.3.3 口服疫苗咀嚼劑制備

將疫苗稀釋至1.0×108TCID50/mL，每頭份咀嚼劑取1mL病毒液、1mL工作濃度佐劑加入到10g犬天然誘食劑中，充分混勻，用模具壓制成骨型，真空、凍干，－20℃保存?zhèn)溆?，一周以后測(cè)定其TCID₅₀。

1.3.4 口服疫苗噴劑制備

將疫苗稀釋至1.0×108TCID50/mL，每頭份取1mL病毒液、1mL工作濃度佐劑和1mL脫脂奶溶液(0.1g/mL)充分混勻，真空、凍干，－20℃保存?zhèn)溆茫恢芤院鬁y(cè)定其TCID₅₀。

1.4運(yùn)輸穩(wěn)定性試驗(yàn)

三種劑型口服疫苗在野外投放前主要通過低溫冷鏈運(yùn)輸，按照最遠(yuǎn)距離計(jì)算從出庫(kù)至各區(qū)疫控中心，再到各免疫點(diǎn)，最后到達(dá)投放點(diǎn)時(shí)間不超過48h。分別將三種劑型口服疫苗置2~8℃冷藏車內(nèi)進(jìn)行48h的運(yùn)輸，期間模擬10次開門卸貨入庫(kù)，每次各取1頭份口服疫苗測(cè)定其TCID50。待口服疫苗返回后入庫(kù)儲(chǔ)存于－20℃備用，分別于入庫(kù)后第3、6、9和12個(gè)月測(cè)定口服疫苗效價(jià)。以儲(chǔ)存于－20℃未經(jīng)運(yùn)輸?shù)膶?duì)應(yīng)口服疫苗作為對(duì)照疫苗。

1.5反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)

將通過運(yùn)輸后重新入庫(kù)的備用疫苗室溫放置12h后，再將其回置－20℃冷凍12h，反復(fù)5次，每次取1頭份測(cè)定其TCID50，剩余疫苗重新入庫(kù)于－20℃以下儲(chǔ)存。以儲(chǔ)存于－20℃未經(jīng)凍融的疫苗作為對(duì)照疫苗。

1.6不同保存溫度下的穩(wěn)定性試驗(yàn)

將反復(fù)凍融后重新入庫(kù)的備用疫苗分別于2~8℃保存4個(gè)月，每隔1個(gè)月取樣檢測(cè)疫苗效價(jià)；于15℃放置1個(gè)月，每周取樣檢測(cè)疫苗效價(jià)；于25℃放置1周，每天取樣檢測(cè)疫苗效價(jià)；于37℃放置3d，每12h取樣檢測(cè)疫苗效價(jià)。均以各溫度下0時(shí)間點(diǎn)的疫苗作為對(duì)照。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析疫苗效價(jià)檢測(cè)結(jié)果均采用lgTCID₅₀/頭份，保留小數(shù)點(diǎn)后2位。用SPSSstatistics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及分析，采用單因素方差分析(F)對(duì)不同條件下的疫苗進(jìn)行病毒滴度比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1運(yùn)輸穩(wěn)定性

結(jié)果見圖1。三種劑型口服疫苗經(jīng)過48h運(yùn)輸和開門卸貨后，凍干劑效價(jià)下降了1.42，咀嚼劑下降了1.00，噴劑下降了1.25，但是三種劑型口服疫苗效價(jià)均能達(dá)到5.75以上。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在不同開門卸貨次數(shù)條件下，咀嚼劑相比凍干劑效價(jià)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_咀嚼劑＝14.810，P＜0.05)；噴劑相比凍干劑也同樣差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_噴劑＝29.133，P＜0.05)。咀嚼劑、噴劑相對(duì)凍干劑效價(jià)下降差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_咀嚼劑＝10.529，F_噴劑＝19.803，P＜0.05)。

運(yùn)輸后入庫(kù)的口服疫苗于－20℃儲(chǔ)存3、6、9、12個(gè)月的效價(jià)變化見圖2。運(yùn)輸后－20℃儲(chǔ)存，凍干劑疫苗效價(jià)下降了0.58，咀嚼劑下降了0.42，噴劑下降了0.92，但是均能達(dá)到5.33以上。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在不同時(shí)間點(diǎn)條件下，凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對(duì)對(duì)照疫苗效價(jià)均差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_凍干劑＝17.488，F_咀嚼劑＝9.418，F_噴劑＝73.846，P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對(duì)凍干劑效價(jià)下降差異同樣不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_咀嚼劑＝2.293，F_噴劑＝2.293，P＞0.05)。

2.2 反復(fù)凍融穩(wěn)定性

運(yùn)輸后重新入庫(kù)的疫苗反復(fù)凍融5次后其效價(jià)變化見圖3。凍融后，凍干劑效價(jià)下降了0.92，咀嚼劑下降了0.75，噴劑下降了0.58，但是均能達(dá)到5.00以上。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，凍融后，咀嚼劑、噴劑相對(duì)凍干劑效價(jià)差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對(duì)凍干劑效價(jià)下降差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F咀嚼劑＝10.529，F噴劑＝19.803，P＜0.05)。

2.3 不同保存溫度下疫苗的穩(wěn)定性

結(jié)果見圖4。

2.3.1 2~8℃保存4個(gè)月

凍干劑效價(jià)下降了0.33，咀嚼劑下降了0.67，噴劑下降了0.67，但是均能達(dá)到5.00以上。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，凍干劑、咀嚼劑相對(duì)對(duì)照疫苗效價(jià)差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；但是噴劑相對(duì)對(duì)照疫苗效價(jià)差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_噴劑＝22.894，P＜0.05)；咀嚼劑、噴劑相對(duì)凍干劑效價(jià)下降差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_咀嚼＝0.982，F_噴劑＝1.549，P＞0.05)。

2.3.2 15℃保存1個(gè)月

凍干劑效價(jià)下降了1.58，咀嚼劑下降了0.75，噴劑下降了1.34，疫苗效價(jià)最低只有3.75。凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對(duì)對(duì)照疫苗效價(jià)差異均不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對(duì)凍干劑效價(jià)下降差異也不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3.3 25℃保存1周

凍干劑效價(jià)下降了2.66，咀嚼劑下降了2.50，噴劑下降了3.34，疫苗效價(jià)最低只有2.50。凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對(duì)對(duì)照疫苗效價(jià)差異均不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對(duì)凍干劑效價(jià)下降差異也不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3.4 37℃保存3d

凍干劑效價(jià)下降了3.66，咀嚼劑下降了4.00，噴劑下降了3.67，疫苗效價(jià)最低只有1.00。凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對(duì)對(duì)照疫苗效價(jià)差異均不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；咀嚼劑、噴劑相對(duì)凍干劑效價(jià)下降差異也不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

腺病毒作為基因傳遞和表達(dá)的有效工具滿足了作為重組疫苗載體的諸多條件，目前已經(jīng)大量的用于疫苗的研發(fā)和臨床基因治療領(lǐng)域，其中研究應(yīng)用最廣泛的為人5型腺病毒。rAd5－ΔE1/E3－CGS屬于表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白基因RABV－G的重組復(fù)制缺陷型人5型腺病毒活載體疫苗，不僅可以高效表達(dá)狂犬病病毒G蛋白，而且其自身的復(fù)制缺陷也增加了口服疫苗的安全性，并獲得了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書。由于口服疫苗對(duì)冷鏈溫度偏移十分敏感，因此在制備、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、投放過程中的溫度和時(shí)間控制尤為重要，高溫影響疫苗效價(jià)，或?qū)е陆臃N無(wú)效；低溫可影響疫苗形態(tài)，直接影響疫苗的安全性和穩(wěn)定性，且形態(tài)變化多是不可逆的，因此在口服疫苗投放使用前，應(yīng)當(dāng)對(duì)口服疫苗在實(shí)際儲(chǔ)運(yùn)和環(huán)境釋放中疫苗效價(jià)的消減規(guī)律進(jìn)行研究。

狂犬病口服疫苗rAd5－ΔE1/E3－CGS在被制備成三種劑型后，效價(jià)均有所下降，其中咀嚼劑下降最多，達(dá)到1.25，可能與犬天然誘食劑中未添加脫脂奶，凍干后保護(hù)能力差有關(guān)。在冷鏈運(yùn)輸和開門卸貨后，雖然相對(duì)凍干劑，咀嚼劑和噴劑效價(jià)差異顯著，但是效價(jià)下降差異并不顯著，疫苗效價(jià)仍然保持在最低5.75以上，證明冷鏈運(yùn)輸中三種劑型口服疫苗均較穩(wěn)定。運(yùn)輸后儲(chǔ)存于－20℃保存1年，三種劑型口服疫苗效價(jià)下降最高不超過1.00，最低疫苗效價(jià)仍可以達(dá)到5.33以上，因此通過運(yùn)輸后進(jìn)入免疫點(diǎn)－20℃保存的口服疫苗保存期至少可以達(dá)到1年。儲(chǔ)存于免疫點(diǎn)的口服疫苗投放前會(huì)經(jīng)過反復(fù)凍融，凍融5次后效價(jià)最高下降了0.92，疫苗效價(jià)最低仍可達(dá)5.00，凍干劑、咀嚼劑和噴劑相對(duì)對(duì)照疫苗效價(jià)差異不顯著，但是咀嚼劑和噴劑相對(duì)凍干劑疫苗效價(jià)下降差異顯著，說明三種劑型口服疫苗對(duì)凍融都具有較強(qiáng)的抵抗力，其中咀嚼劑抵抗凍融的效果最佳，說明野外投放的口服疫苗短暫失溫并不影響疫苗的效價(jià)。

活疫苗效價(jià)的下降值與保存時(shí)間呈正比關(guān)系，但是保存的溫度直接影響疫苗效價(jià)的下降率。2~8℃為口服疫苗的暫存溫度，在保存4個(gè)月后，疫苗效價(jià)最多也只下降了0.67，效價(jià)均在5.00以上，說明凍干更有利于口服疫苗的保存，從而保證口服疫苗在冷藏情況下短期保存并不影響它的效價(jià)。15℃是疫苗野外投放的平均溫度，咀嚼劑在保存2周后，疫苗效價(jià)仍然能夠達(dá)到4.67，說明咀嚼劑在野外投放溫度不超過15℃的情況下，其投放的有效時(shí)間可達(dá)2周。25℃和37℃情況下疫苗效價(jià)下降非?？?，且溫度越高，效價(jià)下降越快，差異越不明顯，這與Shrivastava等人研究結(jié)果一致，因此高溫季節(jié)不建議進(jìn)行狂犬病口服疫苗的野外投放。

國(guó)內(nèi)流浪犬貓狂犬病口服疫苗免疫尚處于探索階段，rAd5－ΔE1/E3－CGS已被證明能產(chǎn)生較好的中和抗體，雖然目前病毒滴度還夠高，不能滿足大規(guī)模的臨床應(yīng)用，但梁武等人采用細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)工藝實(shí)現(xiàn)了PCV2的量產(chǎn)，為優(yōu)化rAd5ΔE1/E3CGS培養(yǎng)條件、提高病毒滴度、逐步實(shí)現(xiàn)其量產(chǎn)提供了研究思路。本研究為狂犬病rAd5－ΔE1/E3－CGS口服疫苗的野外釋放提供了數(shù)據(jù)支撐，也為流浪動(dòng)物和野生動(dòng)物的狂犬病疫苗口服免疫提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：略

來(lái)源：中國(guó)獸藥雜志2023年4月第57卷第4期