技術交流

國家豬瘟參考實驗室劉業(yè)兵團隊對重要人獸共患病“尼帕病毒”的檢測技術研究進行綜述，并在中國獸藥雜志刊發(fā)，李芳韜博士為第一作者。尼帕病毒（Nipah virus, NiV）是一種人畜共患的高致病性病毒，人感染NiV后，死亡率接近40%；豬作為中間宿主，感染NiV后具有高發(fā)病率和高死亡率特點。近年來，NiV疫情在我國相鄰的多個東南亞國家頻繁出現(xiàn)，預示該病傳入我國風險日益增高。

近年來NiV在血清學診斷和分子學診斷技術方面的研究進展，包括臨床常用的傳統(tǒng)技術，以及重組蛋白ELISA、Luminex、二代測序等新興診斷方法，為臨床樣本中NiV的鑒定和監(jiān)測方法更新?lián)Q代提供參考，對監(jiān)測NiV從國外的傳入情況、防控豬群NiV疫情發(fā)生以及守護公共衛(wèi)生安全具有重大意義。

NiV血清學傳統(tǒng)診斷方法主要包括ELISA和血清中和試驗，常用靶標為NiV的F蛋白、G蛋白和N蛋白。其中，血清中和試驗需要在生物安全四級實驗室中進行，是NiV實驗室診斷的“黃金”標準；ELISA是一種安全性好、敏感性高、特異性強和經(jīng)濟實惠的診斷工具，可用于臨床樣本的大規(guī)模流行病學調查和持續(xù)監(jiān)測。目前，檢測NiV常用ELISA方法包括捕獲ELISA檢測IgM抗體和間接ELISA檢測IgG抗體。以往研究表明，第一代間接ELISA結果存在非特異性反應，須由在生物安全四級實驗室中操作的血清中和試驗進一步確定ELISA結果，使NiV陽性樣本的篩選不具有普適性。因此，開發(fā)和評價用于篩查NiV疑似病例的ELISA新方法，有助于監(jiān)測豬群NiV疫情以及制定公共衛(wèi)生預防措施。隨著診斷技術的發(fā)展和進步，近些年來逐漸研發(fā)出更多適用于NiV疫情監(jiān)測的新方法，對于新技術的開發(fā)使現(xiàn)有的血清學分析得以改進，主要包括以下技術：

1.1 基于重組蛋白的ELISA鑒別方法

由于NiV具有高度危險性，利用重組蛋白代替全病毒作為ELISA檢測抗原，可適用于臨床樣本的流行病學調查。NiV的G蛋白和N蛋白可以用于建立NiV間接ELISA檢測方法，進行陽性血清的篩選以及NiV與亨德拉病毒(HendraVirus,HeV)的鑒別診斷。使用不同的表達系統(tǒng)表達HeV和NiV截短形式的G蛋白以及NiV的全長N蛋白，以這些重組蛋白為基礎，采用ELISA檢測豬血清中HeV或NiV特異性抗體,以達到鑒定NIV或HeV目的。因為HeV和NiV的交叉反應性，可以通過使用基于全長N蛋白的ELISA對血清進行初篩，然后再用基于截短G蛋白的ELISA區(qū)分HeV和NiV感染。但是HeV和NiV均屬亨德拉尼帕病毒屬，抗原之間密切相關，為了排除交叉反應與假陽性現(xiàn)象，仍需進行血清中和試驗才能確認為NiV陽性。

1.2 基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA

采用基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA方法，可以用于檢測咽拭子、鼻拭子、腦脊液、尿液和血液中的NiV感染。經(jīng)研究表明，該方法能夠更快速地診斷常規(guī)PCR方法無法檢測到的新型NiV。雖然PCR是診斷NiV感染最敏感的技術，但當病毒變異后，可能會造成PCR鑒定方法失效。因此，這種基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA方法可以在血清學層面鑒定到新型NiV感染，補充傳統(tǒng)血清學方法和PCR方法在檢測過程中可能遺漏的陽性病例。

1.3 Luminex測定抗體法血清學診斷方法

除了傳統(tǒng)的ELISA和血清中和試驗診斷方法，還有一種Luminex測定法已開發(fā)用于NiV的血清學檢測，包括設計用于抗體檢測和鑒別的Luminex結合測定法，以及設計用于病毒中和的Luminex阻斷測定法。該技術通過在不同熒光編碼的微球上進行抗原－抗體結合反應，運用激光分別檢測微球編碼和報告熒光來達到定性和定量的目的，一個反應孔內(nèi)可以完成多種不同的生物學反應，可同時檢測上百種生物靶標，并且在數(shù)小時內(nèi)完成檢測。通過對臨床樣本的篩選結果進行比較，結合測定法和阻斷測定法可以替代傳統(tǒng)的ELISA和血清中和試驗。因此，Luminex測定法是一種快速、靈敏、特異的檢測臨床樣本血清中NiV的有效替代方法。并且該方法不需要在活細胞上培養(yǎng)病毒，無需在生物安全四級實驗室中進行，適用于臨床疾病診斷和流行病學監(jiān)測可能需要的大批量操作條件。

ELISA可以用來準確測定大批量生物樣品，但傳統(tǒng)ELISA只能分析一個目標分子，不具備同時分析多種目標分子的能力。在ELISA基礎上發(fā)展的Luminex測定法不僅可以替代傳統(tǒng)方法，還可以在一次實驗中完成對多種目標分子的分析，從而建立了更加高效、快速的分析平臺。

1.4 基于假病毒的中和試驗

由于NiV中和試驗不具有普適性，因此可以通過構建NiV假病毒，設計基于假病毒的NiV中和試驗。已有研究通過基因重組技術構建了單獨表達F或G蛋白的重組水泡性口炎病毒作為已知抗原，并在此基礎上建立了檢測NiV抗體的空斑抑制試驗；或利用基因重組技術構建了共表達F、G蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)的重組水泡性口炎病毒，作為已知病毒抗原檢測NiV血清樣本。上述表達綠色熒光蛋白或熒光素酶的NiV假病毒被稱為第一代假病毒。在檢測過程中，基于NiV第一代假病毒的中和試驗仍需要特定的檢測設備以檢測熒光蛋白或熒光素酶。所以，在上述假病毒的基礎上，NiV第二代假病毒采用表達分泌型堿性磷酸酶的水泡性口炎病毒模型重組F和G蛋白，通過使用ELISA酶標儀測量上清液中的分泌型堿性磷酸酶活性，從而開發(fā)出一種新型的基于NiV假病毒的血清中和試驗檢測方法，其結果與傳統(tǒng)的活體NiV試驗獲得的抗體檢測結果一致。

分子學診斷方法主要包括一系列針對病毒核酸的檢測方法，除了傳統(tǒng)PCR方法外，還有實時熒光逆轉錄-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)、多重PCR、逆轉錄PCR和雙重套式RT-PCR等方法，以及多種核酸測序方法。在臨床上，通過采集腦、肺、脾臟或淋巴結等組織，可用于NiV的初篩及進一步鑒定。針對NiV的M、N和P基因保守區(qū)域設計引物監(jiān)測疑似NiV感染樣本，常用于東南亞地區(qū)爆發(fā)NiV疫情時的病毒鑒定。其中，qRT-PCR作為目前應用最為普遍的分子學診斷方法,已被證明比傳統(tǒng)PCR靈敏1000倍，因此在多次疫情爆發(fā)時使用,其批間和批內(nèi)差異小、重復性好、操作簡單、安全、快速，已成為病原分子診斷的金標準。除了PCR方法外，還有更多新興分子學方法可以用于NiV診斷，主要包括以下技術：

2.1Luminex測定核酸法Luminex測定法

除了可以應用于NiV的血清學檢測，還可以應用于NiV的核酸檢測，對HeV和NiV分離株進行檢測和鑒別，并且檢測靈敏度與qPCR相當。已有研究通過利用低聚標記微球構建了用于HeV和NiV檢測和鑒別的多重鑒定方法，針對N蛋白和P蛋白編碼基因的多個位點構建Luminex測定法，使微球懸浮陣列系統(tǒng)能夠在一次反應中同時識別多個核苷酸靶標，其結果與已有的qPCR相比，Luminex測定法可明確鑒別HeV和NiV感染病例，并且HeV檢測的敏感性與qPCR相當，具有較高的分析和診斷特異性和敏感性。

2.2二代測序

基于PCR結果的一代測序在過去NiV的發(fā)現(xiàn)和診斷中起關鍵作用，對NiV擴增產(chǎn)物的測序可以進一步證實檢測結果，并且對研究病毒基因突變和病毒基因演化方面具有重要作用。隨著二代測序的普遍應用，相比于一代測序大幅降低了經(jīng)濟成本，并且在保持測序準確性的同時，大幅降低了測序時間。利用二代測序從初篩陽性的樣本中獲取NiV全長基因組，以及鑒定新型NiV毒株，是目前最快捷、有效的診斷與分析流程。

隨著技術的進一步發(fā)展，具有巨大測序深度的高通量測序，在排除大量宿主及環(huán)境背景信息的干擾后能夠檢測到較小基因組的病毒，可以不進行PCR步驟、直接在臨床和環(huán)境樣本中檢測NiV核酸，為更加直接、精確地從樣本中鑒定NiV基因信息提供了技術支持。該深度測序診斷方法設計了基于生物素化RNA誘餌原理的病毒富集板，能夠特異性捕獲并富集宏基因組中的病毒信號，可顯著提高檢測背景信息復雜臨床樣品的敏感性，對于感染多種病原的樣本，能夠同時檢測到不同種病原的遺傳信息。

血清中和試驗雖然是NiV實驗室診斷的“黃金”標準，但是在臨床采樣檢測和攻毒實驗中，血清中和試驗的檢測陽性率低于qRT-PCR和ELISA檢測陽性率。ELISA試驗作為普遍應用的血清學檢測方法，無需在生物安全四級實驗室中即可進行檢測；然而，其敏感性和特異性略低于分子檢測技術，如RT-PCR、qRT-PCR和其他分子生物學方法，無法快速、敏感和特異性地檢測到NiV。在NiV疫情再次爆發(fā)時，PCR方法和基因組測序結果對于NiV的遺傳學分析和分子特征研究是必不可少的，但是由于引物靶向序列的局限性，PCR診斷方法無法適應病毒的快速變異，可能會造成PCR鑒定方法失效。因此，只有將多種檢測方法相結合，才能更加快速、高效地診斷NiV,對防控豬群NiV疫情發(fā)生、監(jiān)測NiV從國外的傳入情況以及守護公共衛(wèi)生安全具有重大意義。

在目前的研究中，為了更精確的篩查臨床樣本中的NiV陽性病例，可先采用qRT-PCR方法初步篩選大量臨床樣本中的陽性樣本，再采用ELISA方法對陽性樣本的血清抗體進行進一步篩選及確認，最后利用二代測序(NGS)對組織和拭子樣本進行NiV的全基因組測序。隨著NiV假病毒相關研究的進一步發(fā)展，NiV的血清中和試驗無需在生物安全四級實驗室中進行，使血清中和試驗作為NiV實驗室診斷的“黃金”標準有望在日后進一步推廣；而具有巨大測序深度的高通量測序，能夠排除大量宿主及環(huán)境背景信息的干擾，并且可以不進行PCR步驟、直接在臨床和環(huán)境樣本中檢測NiV核酸，為更加直接、精確地從樣本中鑒定NiV基因信息提供了技術支持，也有利于NiV檢測進一步從實驗室推廣到臨床。

NiV的高發(fā)病率和高死亡率，對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全構成了重大威脅。目前，通過臨床癥狀難以鑒別NiV與豬群中長期存在的呼吸道癥狀為主要表征的病毒，為臨床診斷NiV造成了巨大困難。所以，在發(fā)展實驗室診斷技術的同時，應進一步簡化操作步驟，發(fā)展易于臨床操作的快速診斷分析技術，以降低我國NiV流行的潛在風險，防控該病的輸入與爆發(fā)。