根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織制定了雞傳染性支氣管炎活疫苗非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法等4項(xiàng)檢測(cè)方法，現(xiàn)予發(fā)布，自發(fā)布之日起執(zhí)行。 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將加強(qiáng)對(duì)雞傳染性支氣管炎活疫苗等4種獸用疫苗產(chǎn)品監(jiān)督抽檢力度，對(duì)發(fā)現(xiàn)的非法添加或改變制苗用毒種行為，按照獸藥嚴(yán)重違法行為從重處罰情形嚴(yán)厲查處。 1.雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法 2.雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法 3.雞新城疫活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法 4.禽用滅活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原檢測(cè)方法附件1：
雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法
1. 1 本方法適用于雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測(cè)。1. 2 非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測(cè)范圍為 GI- 1 譜系(Mass-like)、GI-13 譜系(4/91-like)、GI-19 譜系(QX-like)和 GI-22 譜系(LDT3-A-like)的雞傳染性支氣管炎病毒核酸。針對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)不同毒株基因序列差異區(qū),分別設(shè)計(jì)針對(duì) IBV 的一對(duì)通用型引物和檢測(cè) GI-1 譜系(Mass-like)、GI-13 譜系(4/91-like)、GI-19 譜系(QX-like)和 GI-22 譜系(LDT3A-like)的 4 對(duì)特異性引物，詳見表 1。表 1 檢測(cè) IBV 的通用型引物和不同譜系毒株的特異性引物
GI-1 譜系(Mass-like) 代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(H120 株),毒種編號(hào)為 CVCC AV1514;GI-13 譜系(4/91-like) 代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/49101 株),毒種編號(hào)為 CVCC AV1567;GI-19 譜系(QX-like) 代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/ QX01 株),毒種編號(hào)為 CVCC AV1568;GI-22 譜系(LDT3A-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/ ldt3a01 株),毒種編號(hào)為 CVCC AV1569。以上代表毒株均來源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。RNA 提 取 試 劑 盒、 RT - PCR 試 劑、 瓊 脂 糖、 50xTAE、 DNA marker、無核酸酶水、生理鹽水。取疫苗按瓶簽標(biāo)示，用生理鹽水稀釋至每毫升至少含 250 羽份；陽性對(duì)照按瓶簽標(biāo)示原倍或 10 倍稀釋后使用。將稀釋后的疫苗和陰、陽性對(duì)照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行 RNA 核酸提取。將 3. 2 步驟提取的 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作,按商品化的一步法RT-PCR 試劑盒說明書進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)。RT-PCR 反應(yīng)程序如下：第一階段,反轉(zhuǎn)錄 50℃ 30min；第二階段,預(yù)變性 92℃ 2min;第三階段,PCR 擴(kuò)增 94℃ 30s，55℃ 30s,72℃ 1min,共 30 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸 5min。RT-PCR 反應(yīng)體系見表 2:表 2 RT-PCR 反應(yīng)體系(50μL)
配制 1% 瓊 脂 糖 凝 膠, 取 10μL RT - PCR 產(chǎn) 物 進(jìn) 行 電 泳，120V，30min。4. 1 試驗(yàn)成立條件:陰性對(duì)照應(yīng)無條帶,各譜系代表毒株應(yīng)擴(kuò)增出相應(yīng)大小條帶,分別為:雞傳染性支氣管炎病毒通用引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 266bp 的條帶;GI-1 譜系 ( Mass - like) 代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(H120 株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 360bp 的條帶;GI-13 譜系(4/91 -like) 代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/49101 株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 328bp 的條帶;GI-19 譜系(QX-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/ QX01 株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 340bp 的條帶;GI-22 譜系(LDT3A-like) 代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/ ldt3a01 株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 787bp 的條帶。4. 2 檢測(cè)樣品如不出現(xiàn)大小約為 266bp 的條帶，則判定樣品中不含 IBV 核酸;檢測(cè)樣品如出現(xiàn)大小約為 360bp 的條帶，則判定樣品中檢出 GI-1 譜系(Mass-like) 的 IBV 核酸;如出現(xiàn)大小約為328bp 的條帶，則判定樣品中檢出 GI-13 譜系(4/91-like) 的 IBV核酸;如出現(xiàn)大小約為 340bp 的條帶，則判定樣品中檢出 GI-19 譜系(QX-like)的 IBV 核酸；如出現(xiàn)大小約為 787bp 的條帶，則判定樣品中檢出 GI-22 譜系(LDT3A-like)的 IBV 核酸。
附件2：
雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法
1. 1 本方法適用于雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測(cè)。1. 2 非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測(cè)范圍為雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株、中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力毒株、弱毒力毒株、變異株的雞傳染性法氏囊病病毒核酸。針對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)不同毒力毒株基因序列差異區(qū),參考 WOAH《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》第 3. 3. 12 雞傳染性法氏囊病,設(shè)計(jì) VP2 高變區(qū)的一對(duì)通用引物。Upper U3: 5’-GCATGCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3’,Lower L3: 5’-GAATTCGATCCTGTTGCCACTCTTTC-3’雞傳染性法氏囊病病毒陽性對(duì)照分別為：超強(qiáng)毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(SD1205E5 株)，毒種編號(hào)為 CVCC AV358，來源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌( 毒) 種保藏中心；中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(CF 株),毒種編號(hào)為 CVCC AV164，來源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心；雞傳染性法氏囊病病毒(NF8 株)，來源于乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠;弱毒力毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(B87 株)，毒種編號(hào)為 CVCC AV140,來源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心；變異株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(LN2023 株)，毒種編號(hào)為 CVCC AV1570,來源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。RNA 提取試劑盒、RT-PCR 試劑、DNA 片段回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶 EagI-HF 和 StuI、瓊脂糖、50xTAE、DNA marker、無核酸酶水、生理鹽水。取疫苗按瓶簽標(biāo)示,用生理鹽水稀釋至每毫升至少含 10羽份。陽性對(duì)照病毒含量至少應(yīng)為 100ELD50/0. 1ml。將稀釋后的疫苗和陰、陽性對(duì)照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行 RNA 核酸提取。將 3. 2 步驟提取的 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。RT-PCR 反應(yīng)程序如下：第一階段，反轉(zhuǎn)錄，用六聚體隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物獲得cDNA，在 0. 2ml PCR 管中加入:RNA 8μL，random hexamers(50μg/μL) 1μL，10mM dNTP mix 1μL，沸水浴 5min，冰浴 2min；再加入10μL cDNA 合成預(yù)混液，反應(yīng)體系見表 1。表 1 cDNA 合成預(yù)混液成分(10μL)
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:25℃10min；50℃50min；85℃5min。第二階段，95℃ 3min；95℃ 40s,60℃ 30s，72℃ 40s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10min。反應(yīng)體系見表 2:
3. 4PCR 產(chǎn)物回收、酶切利用片段回收試劑盒對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收,最終用 32μL 無核酸酶水進(jìn)行洗脫。將回收產(chǎn)物利用 EagI-HF 和 StuI 進(jìn)行酶切，酶切體系(50μL)：10x Cutsmart Buffer 5μL，DNA 30 μL，EagI-HF1μL，StuI 1μL，ddH2O 13μL，混勻后 37℃水浴 4h。
3. 5 電泳
配 置 2% 瓊 脂 糖 凝 膠, 取 10μl 酶 切 產(chǎn) 物 進(jìn) 行 電 泳，130V,40min。
4. 結(jié)果判定
4. 1 試驗(yàn)成立條件,陰性對(duì)照應(yīng)無條帶,不同毒力代表毒株應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)大小條帶,分別為:
超強(qiáng)毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(SD1205E5 株)、中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(CF 株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為 234bp、233bp 和 89bp 條帶,實(shí)際檢測(cè)中僅可見234bp 左右的一個(gè)條帶，原因?yàn)?233bp 條帶和 234bp 條帶差異過小,會(huì)出現(xiàn)重疊。89bp 條帶片段過小，電泳不可見。
弱毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(B87 株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為 556bp 條帶。
變異株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(LN2023 株)和中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(NF8 株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為 322bp 和 234bp 條帶。
4. 2 檢測(cè)樣品如出現(xiàn)大小約為 556bp 的條帶，則判定樣品中檢出 B87 株類似 IBDV 核酸；如出現(xiàn)大小約為 234bp 的條帶，則判定樣品中檢出 CF 株類似或者 SD1205E5 株類似 IBDV 核酸；如出現(xiàn)大小約為 322bp 和 234bp 的條帶，則判定樣品中檢出 LN2023 株類似株或者 NF8 株類似 IBDV 核酸。
4. 3 如需明確具體的雞傳染性法氏囊病病毒種類,可將酶切片段回收后進(jìn)行測(cè)序和 blast 比對(duì)。
雞新城疫活疫苗中非法添加/ 改變制苗用毒種檢測(cè)方法
1. 1 本方法適用于雞新城疫活疫苗中非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測(cè)。1. 2 非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測(cè)范圍為基因Ⅶ型新城疫病毒核酸。1. 3 檢測(cè)對(duì)象為雞新城疫活疫苗 La Sota 株、Clone30 株、F 株、HB1 株、 N79 株、 CS2 株、 V4/ HB92 株、 ZM10 株、 VG/ GA 株 等 疫苗株。針對(duì)雞新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)F 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)通用型引物。NDV-F(Universas 型)-F:5’-ACAGGRTCAATCATAGT-3’NDV-F(Universas 型)-R:5’-CAGTAWGAGGTGTCAAG -3’針對(duì)基因Ⅶ型新城疫病毒 F 基因差異序列，設(shè)計(jì)一對(duì)基因Ⅶ型特異性引物。NDV-F(Ⅶ型)-F:5’-AGTTTAATAATACGGCGCGA-3’NDV-F(Ⅶ型)-R:5’-GCAATAACTGAGCCYYTAAG -3’雞新城疫病毒 La Sota 株，毒種編號(hào)為 CVCC AV1615，來源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。基因Ⅶ型新城疫病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品，編號(hào)為 CVCC Z333，來源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。RNA 提 取 試 劑 盒、 RT - PCR 試 劑、 瓊 脂 糖、 50xTAE、 DNA取疫苗按瓶簽標(biāo)示,用生理鹽水稀釋至每毫升至少含 100 羽份；;陽性對(duì)照按瓶簽標(biāo)示原倍或 10 倍稀釋后使用。將稀釋后的疫苗和陰、陽性對(duì)照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行 RNA 核酸提取。將 3. 2 步驟提取的 RNA 進(jìn)行一步法 RT-PCR 反應(yīng)，一步法 RT-PCR 反應(yīng)程序如下:50°C 30min,92°C 2min、94°C 30s、55°C 30s、72°C 1min,共 30 個(gè)循環(huán),最后 72°C 延伸 10min。一步法 RT-PCR反應(yīng)體系見表 1:表 1 一步法 RT-PCR 反應(yīng)體系(25μL)
3. 4 電泳
配置 1% 瓊 脂 糖 凝 膠, 取 10μl RT - PCR 產(chǎn) 物 進(jìn) 行 電 泳，120V，30min。
4. 結(jié)果判定
4. 1 試驗(yàn)成立條件,新城疫病毒(La Sota 株)通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 842bp 條帶，基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物應(yīng)無條帶；基因Ⅶ型新城疫病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 842bp 條帶，基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 609bp 特異性條帶；陰性對(duì)照均無條帶，則試驗(yàn)成立。
4. 2 樣品用新城疫病毒通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為 842bp條帶。若用基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物擴(kuò)增出大小約為609bp 條帶，則判定樣品中檢出基因Ⅶ型新城疫病毒核酸。
附件4：
禽用滅活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原檢測(cè)方法
1. 適用范圍
1. 1 本方法適用于禽用滅活疫苗中非法添加制苗用毒種的檢測(cè)。
1. 2 非法添加制苗用毒種的檢測(cè)范圍為禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原。
2. 試驗(yàn)材料
2. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF 雞，4 ~6 周齡。
2. 2 試劑
禽腺病毒Ⅰ群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原，陰性對(duì)照為 SPF 雞血清，陽性對(duì)照為禽腺病毒Ⅰ群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)陽性血清，均來源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；瓊脂粉或瓊脂糖、氯化鈉、PBS(0. 01M、pH7. 2)。
3. 檢測(cè)方法
3. 1 免疫
用 4 ~6 周齡 SPF 雞 15 只,其中 10 只雞按制品推薦的免疫途徑和劑量進(jìn)行免疫。首次免疫后 14 天，按照相同途徑(不同部位)和劑量進(jìn)行第二次免疫。另取 5 只作為不免疫對(duì)照組。第二次免疫后 21 日每只雞分別采血，分離血清，用禽腺病毒 I 群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定。
3. 2 抗體效價(jià)測(cè)定
3. 2. 1 瓊脂板制備
稱取優(yōu)質(zhì)瓊脂粉或瓊脂糖 1g、氯化鈉 8g,加入 PBS(0. 01M、pH7. 2)溶液 100ml 中，置沸水中水浴加熱融化，室溫冷卻至 60 ~65℃ 后，倒入無菌平皿內(nèi)(瓊脂厚度約為 5mm)，冷凝后加蓋倒置平皿，防止水分蒸發(fā)，隔日使用應(yīng)在 2 ~8℃保存。
3. 2. 2 打孔
用六角形打孔器在瓊脂上打孔，孔徑 3 ~4mm，孔間間距 3mm。
3. 2. 3 封底
挑出孔中瓊脂后,將平皿底部至酒精燈上微微加熱，使孔底瓊脂稍微融化封底。
3. 2. 4 加樣
中央孔滴加瓊擴(kuò)抗原 50μl，第 2、4 孔滴加陽性對(duì)照各 50μl，第6 孔滴加陰性對(duì)照 50μl,第 1、3、5 孔滴加待檢血清，每孔 50μl。
3. 2. 5 反應(yīng)將瓊脂板放入濕盒中，置 37℃溫箱內(nèi) 2 小時(shí)后倒置瓊脂板，繼續(xù)作用至 24 小時(shí)，然后移至室溫再放置 48 ~ 72 小時(shí)，觀察沉淀線。
3. 2. 6 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)抗體檢測(cè)結(jié)果判定
3. 2. 6. 1 試驗(yàn)成立條件，抗原孔與陽性對(duì)照之間出現(xiàn)沉淀線，與陰性對(duì)照之間無沉淀線出現(xiàn)，抗體檢測(cè)試驗(yàn)成立。
3. 2. 6. 2 當(dāng)待檢血清與抗原孔之間形成沉淀線，并與陽性對(duì)照的沉淀線末端吻合，則待檢血清判為陽性；當(dāng)待檢血清與抗原孔之間未形成沉淀線，但陽性對(duì)照的沉淀線末端向待檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎,則判為弱陽性。弱陽性樣品應(yīng)重檢一次，仍為弱陽性時(shí)可判為陽性；當(dāng)待檢血清與抗原孔之間未形成沉淀線，或陽性對(duì)照與抗原孔間的沉淀線末端向毗鄰的待檢血清孔直伸或向外側(cè)偏彎時(shí)，則判該待檢血清為陰性。
4. 結(jié)果判定
4. 1 試驗(yàn)成立條件,對(duì)照組雞 AGP 抗體應(yīng)全部為陰性,試驗(yàn)成立。
4. 2 若待檢樣品免疫雞血清 1 份及以上出現(xiàn) AGP 抗體陽性，則判定該疫苗中添加了禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原；若待檢樣品免疫雞血清均未出現(xiàn) AGP 抗體陽性，則判定該疫苗中未添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原。
來源：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部。
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