在研項(xiàng)目

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)屬于黃病毒科中的一種具有囊膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA病毒，能引起豬只發(fā)生急性、熱性和全身敗血性疾病。CSFV野毒株的毒力差異很大，強(qiáng)毒株可引起豬只發(fā)生典型的豬瘟癥狀，通常表現(xiàn)為高熱、極度嗜睡、體內(nèi)器官呈敗血性變化，致死率高，臨床上比較少見(jiàn)；中等毒力的毒株可引起豬只高熱、輕度嗜睡、淋巴器官內(nèi)輕度出血，但致死率低。妊娠母豬感染CSFV后可經(jīng)胎盤垂直傳遞給胎兒，產(chǎn)生弱仔豬、死胎、木乃伊胎；種用公豬感染CSFV后引起精液帶毒；初生仔豬感染CSFV后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為持續(xù)性感染并終身帶毒，出現(xiàn)免疫耐受。近年來(lái)，CSFV給世界各地養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，盡管豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)可以有效預(yù)防豬瘟的發(fā)生，但在免疫壓力和氣候環(huán)境等多種因素的影響下，CSFV已經(jīng)出現(xiàn)變異。胡玲玲等分離出CSFV GZA株，該毒株的E2基因序列與我國(guó)CSFV參考毒株序列［標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)毒株Shimen株(GenBank登錄號(hào)為AY775178)、C株(GenBank登錄號(hào)為Z46258)、HCLV株(GenBank登錄號(hào)為AF531443)］相比存在多個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)。傳統(tǒng)CSFV檢測(cè)技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，但近年來(lái)出現(xiàn)的許多基于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新而來(lái)的新型CSFV檢測(cè)技術(shù)，在靈敏度、操作方法、檢測(cè)成本等方面都有所優(yōu)化。筆者綜述了傳統(tǒng)CSFV檢測(cè)技術(shù)及新型CSFV檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展，旨在為臨床CS-FV檢測(cè)提供方法參考。

ELISA是將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上進(jìn)行免疫反應(yīng)的一種定性和定量方法，是臨床上最受歡迎的檢測(cè)CSFV方法之一。陳九等利用大腸桿菌表達(dá)CSFVE2蛋白主要抗原區(qū)，建立了CSFV間接ELISA抗體檢測(cè)方法，并對(duì)556份臨床疑似豬瘟樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，與豬瘟阻斷ELISA試劑盒(美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn))的陽(yáng)性符合率為90.8%，陰性符合率為93.29%，總符合率為91.52%。侯玉珍等建立了針對(duì)CSFVE2重組蛋白的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，結(jié)果表明，CSFVE2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋濃度在2.43~77.65μg/mL范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，且重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)小于15%，表明該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，為CSFVE2蛋白的定量檢測(cè)提供了良好的方法。吳許丹等建立了檢測(cè)CSFV EO抗體的ELISA方法，結(jié)果表明，該方法特異性、穩(wěn)定性和靈敏性均良好。ELISA具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單快速、抗原不需要提前純化、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但存在成本較高、專一性較差、交叉反應(yīng)發(fā)生的概率高、操作過(guò)程被局限在實(shí)驗(yàn)室而不能進(jìn)行室外檢測(cè)等缺點(diǎn)，見(jiàn)表1。

1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)

PCR是臨床上最常用的CSFV檢測(cè)方法之一，具有快速、經(jīng)濟(jì)、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。目前，許多地區(qū)發(fā)生的豬瘟已不再由單一的CSFV感染所引起，而是由多種病毒混合感染所引起。史喜菊等建立了同時(shí)可檢測(cè)和鑒別CSFV、非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)和豬水泡病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)的多重?zé)晒饽孓D(zhuǎn)錄PCR(revers transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法，結(jié)果表明：該方法最低檢測(cè)量可達(dá)到1~10拷貝/μL，特異性高達(dá)100%。楊峰等建立了檢測(cè)CSFV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)方法，結(jié)果表明該方法具有特異性強(qiáng)(只能檢測(cè)出CSFV)、靈敏度高(最低檢測(cè)量可達(dá)到24.47拷貝/μL)、重復(fù)性好等特點(diǎn)。PCR具有取樣少、靈敏度高、操作快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，RT-qPCR可同時(shí)對(duì)病原體進(jìn)行定量和定性檢測(cè)，由于采用封閉檢測(cè)模式，因此擴(kuò)增產(chǎn)物污染的可能性比普通PCR要小得多；但PCR儀器設(shè)備昂貴，操作專業(yè)性強(qiáng)、過(guò)程復(fù)雜，且在基因擴(kuò)增過(guò)程中容易出現(xiàn)錯(cuò)配現(xiàn)象，使得檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。見(jiàn)表1。

2.1 免疫層析試紙條檢測(cè)技術(shù)

免疫層析試紙條檢測(cè)技術(shù)是基于免疫標(biāo)記技術(shù)和色譜層析技術(shù)發(fā)展起來(lái)的一種可用于檢測(cè)抗原、抗體或半抗原的檢測(cè)技術(shù)。萬(wàn)穎等將膠體金顆粒標(biāo)記的CSFVE2蛋白及其單克隆抗體包被于硝酸纖維素膜(nitrocellulose membrance,NC)上，分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，組裝成檢測(cè)CSFVE2蛋白抗體的膠體金免疫層析試紙條，該試紙條可在5~10min之間完成檢測(cè)，且與其他病毒的陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，靈敏度高。Li X．等基于CS-FVCnC2蛋白研制了一種用于快速檢測(cè)免疫豬瘟疫苗后的豬血清中CSFV抗體效價(jià)的免疫層析試紙條，即將葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal aureus protein A,SpA)和抗CnC2單克隆抗體(anti-CnC2 monoclonal antibodies,mAbs)吸附于NC上，分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，該試紙條可在5min內(nèi)完成檢測(cè)，且不需要任何特殊設(shè)備；利用該試紙條對(duì)含有不同CSFV株血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其敏感性為97.0%，特異性為100%，與CSFV AbELISA試劑盒(購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司)檢測(cè)結(jié)果一致，相關(guān)系數(shù)為0.935。Bai Y．等開發(fā)了一種基于CSFV重組E2蛋白的新型高敏免疫層析試紙條，用于CSFV抗體檢測(cè)，其靈敏度是CnC2試紙條的4倍。免疫層析試紙條操作快速簡(jiǎn)單，成本低，無(wú)需專業(yè)的技術(shù)人員或昂貴的設(shè)備，是一種靈敏度和特異性均高的高通量檢測(cè)方法，但是其所用的病毒抗原是通過(guò)重新折疊的蛋白質(zhì)，沒(méi)有完全恢復(fù)蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，含有半折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，降低了檢測(cè)效率，見(jiàn)表1。

2.2 免疫色譜橫向流動(dòng)檢測(cè)(immunochromatographic lateral flow assay,LFA)

R．Sambandam等開發(fā)了一種用于檢測(cè)CSFV的LFA方法，最低檢測(cè)限為36.8 TCID50/mL，該方法的靈敏度和特異性分別為80.36%和87.10%，用該方法檢測(cè)了72份臨床樣品，陽(yáng)性和陰性檢出率分別為91.84%和87.10%。P．Sastre等為了能同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分CSFV和ASFV抗體，基于CSFVE2蛋白和ASFV VP72蛋白開發(fā)了一種LFA方法，結(jié)果表明，該方法能夠檢測(cè)到ASFV或CSFV抗體，顯示出良好的靈敏度和特異性。CSFV-LFA是一種用于臨床的操作快速的診斷CSFV的方法，無(wú)需專業(yè)的技術(shù)人員或設(shè)備，生產(chǎn)成本相對(duì)較低，重復(fù)性好，但是判定結(jié)果依賴于肉眼觀察，靈敏度較低，見(jiàn)表1。

2.3 抗原捕獲酶免疫分析(antigen-capture enzymeimmuno assay,EIA)

A．Clavijo等開發(fā)了一種用于檢測(cè)CSFV抗原的EIA方法，該方法可直接從組織懸液中檢測(cè)到CSFV抗原，特異性為98.7%，敏感性為91.4%，且操作簡(jiǎn)單，可在4h內(nèi)完成檢測(cè)，并可用于篩查疑似CS-FV感染的豬只組織樣本。EIA對(duì)樣本類型要求不高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，該方法基于抗原和抗體反應(yīng)，受pH值、離子強(qiáng)度、有機(jī)溶劑、反應(yīng)溫度等的影響很大，見(jiàn)表1。

2.4 化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassays,CLIA)

MaZ．等利用CSFV E2重組蛋白和過(guò)氧化酶結(jié)合MAb開發(fā)了一種競(jìng)爭(zhēng)性化學(xué)發(fā)光免疫分析(competition-based chemiluminescence immunoassays,cCLIA)方法，用于快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)豬血清中CSFVE2抗體，結(jié)果表明，該方法的靈敏度和特異性均高于競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(competition-based enzyme-linked immunosorbent assay, cELISA)，且可以在20min內(nèi)完成檢測(cè)，而cELISA至少需要1h。cCLIA方法具有靈敏度高、信噪比高、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，在CSFV的診斷中能夠大幅度的節(jié)省時(shí)間，具有很高的應(yīng)用價(jià)值，但成本較高，儀器故障率較高，發(fā)光過(guò)程短。見(jiàn)表1。

2.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是多種核酸擴(kuò)增技術(shù)中的一種，即通過(guò)對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)3對(duì)特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下作用30~60min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)。Chen L．等建立了一種簡(jiǎn)單、快速的用于檢測(cè)CSFV的反轉(zhuǎn)錄循環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法，即通過(guò)利用一對(duì)外部引物、一對(duì)內(nèi)部引物和一對(duì)循環(huán)引物在恒溫條件下檢測(cè)CSFV，結(jié)果表明，該方法靈敏度高于RT-PCR。

ChenH.T.等評(píng)估了RT-LAMP方法對(duì)經(jīng)典CSFV感染的臨床樣品的檢測(cè)效果，結(jié)果表明：RT-LAMP可以在65℃的恒溫條件下1h內(nèi)完成檢測(cè)，同時(shí)對(duì)未接種豬瘟疫苗的豬的血液、扁桃體、鼻拭子等樣本進(jìn)行RT-LAMP、RT-PCR和病毒分離，三種檢測(cè)技術(shù)的檢出率分別為89%、78%和71%，表明RT-LAMP方法較其他兩種方法敏感性高，但該方法一次只能檢測(cè)5份樣品，與RT-PCR方法相比檢測(cè)進(jìn)度比較慢。RT-LAMP方法是一種快速、經(jīng)濟(jì)、高效的用于檢測(cè)CSFV工具，對(duì)經(jīng)典豬瘟的快速臨床前檢查和監(jiān)測(cè)具有潛在效用。見(jiàn)表1。

2.6 重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(recombinase-aid amplification,RAA)

RAA是一種可以在恒溫下快速擴(kuò)增核苷酸的方法，通常在1h內(nèi)完成檢測(cè)，由于整個(gè)反應(yīng)不需要高溫循環(huán)，因此適合在非實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)合且有大量需要檢測(cè)的臨床樣品情況下使用。已有研究結(jié)果表明，RAA可用于ASFV和PCV2的快速檢測(cè)。TuF.等開發(fā)了一種基于熒光探針的用于檢測(cè)CSFV的實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄重組酶輔助擴(kuò)增(real-time reverse transcription recombinase-aid amplification，rRT-RAA)檢測(cè)方法，靶向所有CSFV基因型中5′非翻譯區(qū)域(5′non-translated region,5′NTR)內(nèi)的高度保守位置，結(jié)果表明，該方法具有良好的重復(fù)性、特異性和靈敏性，并且可以肉眼在便攜式藍(lán)光成像儀下看到rRT-RAA擴(kuò)增產(chǎn)物，是一種可以現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)CSFV的實(shí)用性較強(qiáng)的診斷工具。薛俊欣等建立了基于RAA-Cas13a的CSFV檢測(cè)方法，對(duì)不同濃度的陽(yáng)性質(zhì)粒、陽(yáng)性樣品和7種其他豬病病毒樣品進(jìn)行RAA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Cas13a酶切體系，然后收集熒光，結(jié)果表明，Cas13a酶切體系可以放大普通RAA檢測(cè)信號(hào)，從而提高RAA反應(yīng)的靈敏度，該方法特異性良好，檢測(cè)變異系數(shù)小于5%，可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試，具有推廣應(yīng)用的潛力，對(duì)重組酶的純度要求較高，任何雜質(zhì)都有可能影響反應(yīng)結(jié)果，同時(shí)還需要3種或4種酶參與擴(kuò)增反應(yīng)，它們之間需要合理的比例，才能夠得到預(yù)期的擴(kuò)增結(jié)果。見(jiàn)表1。

2.7 微滴式數(shù)字PCR(microdropled digital PCR，ddPCR)

ddPCR是在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上對(duì)擴(kuò)增前樣品進(jìn)行稀釋處理，即將樣品分為若干微滴小份，每小份可能含有或不含有待檢核酸，經(jīng)擴(kuò)增后，對(duì)每小份進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)熒光信號(hào)結(jié)合泊松分布原理來(lái)判斷核酸的含量。近年來(lái)，ddPCR廣泛應(yīng)用于臨床病原微生物檢測(cè)、腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)中。高曉龍等建立了用于檢測(cè)CSFV的ddPCR方法，該方法最低檢測(cè)限為3.2拷貝/μL，靈敏度高，在讀取結(jié)果時(shí)僅判斷陽(yáng)性或陰性，受擴(kuò)增效率的影響較低，且不依賴Ct值或內(nèi)參基因即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對(duì)數(shù)目，適合于拷貝數(shù)變異研究、極低核酸分子含量樣品的檢測(cè)，但是該方法一次只能檢測(cè)一種樣品，使用范圍比較單一，且需要精密儀器，成本較高，不適合常規(guī)檢測(cè)。見(jiàn)表1。

2.8 其他新型檢測(cè)技術(shù)

C.Aira等開發(fā)了一種基于三重磁珠的檢測(cè)方法，即采用ASFV的VP72和VP30蛋白和CSFV的E2蛋白這些最具免疫原性的抗原來(lái)同時(shí)檢測(cè)兩種病毒抗體，其中對(duì)CSFV抗體的檢測(cè)靈敏度為95.7%，特異性為99.8%。這種多重檢測(cè)方法可以同時(shí)區(qū)分和檢測(cè)ASFV和CSFV抗體，降低成本的同時(shí)減少了工作量，為病毒檢測(cè)提供了有價(jià)值的工具，然而該技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用較少，且只有少數(shù)商用試劑盒可用。見(jiàn)表1。

Y.K.Kim等建立了用以快速區(qū)分3個(gè)基因型的CSFVDNA芯片檢測(cè)方法，即從臨床樣本中提取CSFVRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與CSFVDNA芯片雜交，然后進(jìn)行熒光掃描檢測(cè)CSFV。該方法可快速、準(zhǔn)確地區(qū)分CSFV基因型，有助于CSFV根除策略的實(shí)施，但該方法還處于研發(fā)階段，且需要一系列價(jià)格昂貴的儀器，還沒(méi)有形成產(chǎn)品進(jìn)行大量使用。見(jiàn)表1。

WuY.等開發(fā)了一種以豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、CSFV４種病毒蛋白為捕獲抗原的新型熒光蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)方法，結(jié)果表明，陽(yáng)性樣品的檢出率在95%以上且無(wú)交叉反應(yīng)。這種蛋白質(zhì)生物芯片方法具有操作快速、簡(jiǎn)單、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但因?yàn)槠渲苽涑杀竞芨撸形磸V泛用于動(dòng)物疾病的檢測(cè)。見(jiàn)表1。

Guo X.等設(shè)計(jì)了檢測(cè)CSFV的磁彈性傳感器檢測(cè)系統(tǒng)，結(jié)果表明，該系統(tǒng)的靈敏度約為95Hz/(μg·mL)，檢測(cè)限為0.6μg/mL，雖然傳感器信號(hào)容易受到周圍介質(zhì)影響，但靈敏度和特異性都很好，且成本低，在未來(lái)CSFV檢測(cè)中有良好的應(yīng)用前景。見(jiàn)表1。Zhang Q.等首次提出了ViewRNA原位雜交(insituhybridization,ISH)方法，以揭示CSFVRNA在PK15細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)分布。ViewRNAISH的靈敏度比熒光抗體測(cè)試(fluorescent antibody test,FAT)和免疫組織化學(xué)(immunohistochemical,IHC)方法高，且對(duì)CSFV有很強(qiáng)的特異性，與其他豬相關(guān)病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)。ViewRNAISH能對(duì)病毒做定性、定量、定位分析，靈敏度高，特異性好，但因試劑價(jià)格昂貴而未上市。見(jiàn)表1?！　?/span> 

S.Klangprapan等設(shè)計(jì)了一種以分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer,MIP)為受體的石英晶體微量天平(quartz crystal microbalance,QCM)傳感器，用于檢測(cè)CSFV。MIP價(jià)格低廉，并產(chǎn)生與天然受體相當(dāng)?shù)母哂H和力和選擇性，因此該檢測(cè)傳感器可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到CSFV，為CSFV的快速檢測(cè)開辟了一條新的道路，但尚未廣泛應(yīng)用。見(jiàn)表1。

NingP.等設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)CSFV的金納米顆粒探針，原理是金納米顆粒(gold nanoparticles,AuNPs)可以與CSFVRNA互補(bǔ)的DNA結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生熒光信號(hào)來(lái)證明病毒的存在。該方法檢測(cè)速度快、靈敏度高，而無(wú)需病毒核酸擴(kuò)增，可應(yīng)用于動(dòng)物疫病防控，但該探針的制作步驟復(fù)雜且有一定難度，不適用于CSFV的一般檢測(cè)。見(jiàn)表1。

豬瘟是一種具有高度傳染性的疾病，屬于一類動(dòng)物疫病。近年來(lái)由于CSFV相關(guān)疫苗大量使用，使得大規(guī)模的豬瘟疫病爆發(fā)概率明顯降低，但是一旦出現(xiàn)強(qiáng)變異毒株，現(xiàn)有疫苗將不會(huì)發(fā)揮很好的作用，所以做好養(yǎng)豬場(chǎng)防疫凈化至關(guān)重要。目前傳統(tǒng)ELISA和PCR方法因具有良好的靈敏性和特異性、高效且檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用。近幾年新型檢測(cè)技術(shù)層出不窮，每種技術(shù)都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如需進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)可采取RT-RAA或LFA；如果考慮檢測(cè)成本，可用免疫層析試紙條、LAMP或LFA進(jìn)行檢測(cè)；如果一次需檢測(cè)大量樣品，則不能用LAMP和ddPCR進(jìn)行檢測(cè)。因此在進(jìn)行CSFV檢測(cè)時(shí)應(yīng)該結(jié)合自身設(shè)備條件及檢測(cè)的樣本量而選擇最適合的檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)：略